Ključna razlika - NGS vs Sanger sekvenciranje
Sljedeće generiranje sekvenciranja (NGS) i Sanger sekvenciranje dvije su vrste tehnika sekvenciranja nukleotida razvijene tijekom vremena. Sanger metoda sekvenciranja široko se koristila dugi niz godina i NGS ju je nedavno zamijenio zbog svojih prednosti. Ključna razlika između NGS-a i Sanger-ovog sekvenciranja je u tome što NGS djeluje na principu sekvenciranja milijuna sekvenci istovremeno na brz način kroz sustav sekvenciranja, dok Sanger-ovo sekvenciranje djeluje na principu prekida lanca zbog selektivne inkorporacije dideoksinukleotida pomoću enzima DNA polimeraze tijekom replikacije DNA i rezultirajućeg razdvajanja fragmenata kapilarnom elektroforezom.
SADRŽAJ
1. Pregled i ključna razlika
2. Što je sekvenciranje nukleotida
3. Što je NGS
4. Što je sekvenciranje Sangera
5. Usporedba - NGS vs Sanger sekvenciranje
6. Sažetak
Što je sekvenciranje nukleotida?
Genetske informacije pohranjene su u nukleotidnim sekvencama DNA ili RNA organizma. Proces određivanja ispravnog redoslijeda nukleotida (pomoću četiri baze) u danom fragmentu (u genu, klasteru gena, kromosomu i cjelovitom genomu) poznat je kao sekvenciranje nukleotida. U genomskim studijama, forenzičkim studijama, virologiji, biološkoj sustavnosti, medicinskoj dijagnozi, biotehnologiji i u mnogim drugim područjima vrlo je važno analizirati strukturu i funkciju gena. Postoje različite vrste metoda sekvenciranja koje su razvili znanstvenici. Među njima se Sanger sekvenciranje koje je razvio Frederick Sanger 1977. godine široko koristilo i populariziralo dugo vremena dok ga sekvencija sljedeće generacije nije zamijenila.
Što je NGS?
Sljedeće generiranje sekvenciranja (NGS) termin je koji se koristi za označavanje suvremenih procesa sekvenciranja s velikom propusnošću. Opisuje niz različitih modernih tehnologija sekvenciranja koje su revolucionirale genomske studije i molekularnu biologiju. Te su tehnike Illumina sekvenciranje, Roche 454 sekvenciranje, Ion Proton sekvenciranje i SOLiD (sekvenciranje pomoću Oligo Ligacijske detekcije) sekvence. NGS sustavi su brži i jeftiniji. U NGS sustavima koriste se četiri glavne metode sekvenciranja DNA; pirosekvenciranje, sekvenciranje sintezom, sekvenciranje ligacijom i ionsko poluvodičko sekvenciranje. Paralelno se može sekvencirati veliki broj DNA ili RNA (milijuna). Omogućuje sekvenciranje cijelog genoma organizama u kratkom vremenskom razdoblju, za razliku od Sangerovog sekvenciranja koje traje više vremena.
NGS ima mnogo prednosti u odnosu na konvencionalnu Sangerovu metodu sekvenciranja. To je brzi, precizniji i isplativiji postupak koji se može izvesti s malom veličinom uzorka. NGS se može koristiti u metagenomskim studijama, u otkrivanju varijacija unutar pojedinog genoma zbog umetanja i brisanja itd. Te u analizi ekspresije gena.
Slika_1: Razvoj sekvenciranja NGS-a
Što je Sanger sekvenciranje?
Sangerovo sekvenciranje metoda je sekvenciranja koju su razvili Frederick Sanger i njegovi kolege 1977. godine kako bi se odredio precizan redoslijed nukleotida datog fragmenta DNA. Također je poznato kao sekvencija završetka lanca ili Dideoxy sekvenciranje. Načelo rada ove metode je prekid sinteze lanaca selektivnom ugradnjom lanca koji završava dideoksinukleotide (ddNTP), poput ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP, DNA polimerazom tijekom replikacije DNA. Normalni nukleotidi imaju 3 'OH skupine za stvaranje fosfodiesterske veze između susjednih nukleotida za nastavak stvaranja lanaca. Međutim, ddNTP-ima nedostaje ova 3 'OH skupina i nisu u stanju stvoriti fosfodiesterske veze između nukleotida. Dakle, produljenje lanca je zaustavljeno.
U ovoj metodi, jednolančana DNA koja se sekvencira služi kao lanac matrice za sintezu in vitro DNA. Ostali su zahtjevi oligonukleotidni primer, prekursori deoksinukleotida i enzim DNA polimeraze. Kad su poznati bočni krajevi ciljnog fragmenta, početnici se mogu lako dizajnirati za replikaciju DNA. Četiri odvojene reakcije sinteze DNA provode se u četiri odvojene epruvete. Svaka cijev ima zasebne ddNTP-ove, zajedno s ostalim zahtjevima. Iz određenog nukleotida dodaje se smjesa dNTP i ddNTP. Isto tako, izvode se četiri odvojene reakcije u četiri epruvete s četiri smjese. Nakon reakcija vrši se otkrivanje fragmenata DNA i pretvaranje uzorka fragmenata u informacije o sekvenci. Rezultirajući fragmenti DNA toplotno su denaturirani i odvojeni gel elektroforezom. Ako se koriste radioaktivni nukleotidi, uzorak povezivanja u poliakrilamidnom gelu može se vizualizirati autoradiografijom. Kada se ovom metodom koriste fluorescentno označeni dideoksinukleotidi, može se ublažiti očitanjem gela i proći kroz zraku lasera da bi ga fluorescentni detektor mogao otkriti. Da bi se izbjegle pogreške koje bi mogle nastati kada sekvencu pročita oko i ručno unese u računalo, ova se metoda razvila u upotrebu automatiziranog sekvencera povezanog s računalom. Da bi se izbjegle pogreške koje bi mogle nastati kada sekvencu pročita oko i ručno unese u računalo, ova se metoda razvila u upotrebu automatiziranog sekvencera povezanog s računalom. Da bi se izbjegle pogreške koje bi mogle nastati kada sekvencu pročita oko i ručno unese u računalo, ova se metoda razvila u upotrebu automatiziranog sekvencera povezanog s računalom.
Ovo je metoda koja se koristi za sekvenciranje DNA iz projekta Human Genome. Ova se metoda još uvijek koristi s naprednim izmjenama jer daje točne podatke o redoslijedu, unatoč tome što je skup i spor postupak.
Slika_2: Sanger sekvenciranje
Koja je razlika između NGS i Sanger sekvenciranja?
Diff Article Sredina prije tablice
NGS vs Sanger sekvenciranje |
|
| Sljedeće generiranje sekvenciranja (NGS) odnosi se na suvremene procese sekvenciranja velike propusnosti. Opisuje niz različitih modernih tehnologija sekvenciranja | Sangerovo sekvenciranje metoda je sekvenciranja koju je razvio Frederick Sanger kako bi odredio precizan redoslijed nukleotida datog fragmenta DNA. |
| Isplativost | |
| NGS je jeftiniji postupak jer smanjuje vrijeme, ljudsku snagu i kemikalije. | Ovo je skup postupak, jer je potrebno vrijeme, ljudska snaga i više kemikalija. |
| Ubrzati | |
| To je brže jer se i kemijska detekcija i detekcija signala mnogih niti odvijaju paralelno. | To zahtijeva puno vremena jer se otkrivanje kemikalija i otkrivanje signala događaju kao dva odvojena procesa i istodobno mogu čitati samo na niti. |
| Pouzdanost | |
| NGS je pouzdan. | Sanger sekvenciranje je manje pouzdano |
| Veličina uzorka | |
| NGS zahtijeva manju količinu DNA. | Za ovu metodu potrebna je velika količina DNA uzorka. |
| DNA baze po sekvenciranom fragmentu | |
| Broj DNA baza po sekvenciranom fragmentu niži je od Sangerove metode | Generirajuće sekvence dulje su od NGS sekvenci. |
Sažetak - NGS vs Sanger sekvenciranje
NGS i Sanger sekvenciranje su tehnike sekvenciranja nukleotida koje se opsežno koriste u molekularnoj biologiji. Sanger sekvenciranje je rana metoda sekvenciranja koja je zamijenjena NGS. Glavna razlika između NGS-a i Sangerovog sekvenciranja je u tome što je NGS brzi, točniji i isplativiji postupak od Sangerovog sekvenciranja. Obje su tehnike stvorile velike epidemije u genetici i biotehnologiji.
