Ključna razlika - Sanger sekvenciranje vs pirosekvenciranje
DNK sekvenciranje je vrlo važno za DNK analizu jer poznavanje pravilnog rasporeda nukleotida na određenom DNA području otkriva mnoge važne informacije o njemu. Postoje različite metode sekvenciranja DNA. Sanger sekvenciranje i pirosekvenciranje dvije su različite metode sekvenciranja DNA koje se široko koriste u molekularnoj biologiji. Ključna razlika između Sangerovog sekvenciranja i pirosekvenciranja je u tome što Sangerovo sekvenciranje koristi dideoksinukleotide za prekid sinteze DNA radi očitavanja nukleotidne sekvence, dok pirosekvenciranje otkriva oslobađanje pirofosfata ugrađivanjem nukleotida i sintetiziranjem komplementarne sekvence kako bi se pročitao precizan redoslijed sekvence.
SADRŽAJ
1. Pregled i ključna razlika
2. Što je Sanger sekvenciranje
3. Što je pirosekvenciranje
4. Usporedna usporedba - Sanger sekvenciranje u odnosu na pirosekvenciranje
5. Sažetak
Što je Sanger sekvenciranje?
Sanger sekvenciranje je metoda sekvence DNA prve generacije koju su razvili Frederick Sanger i njegovi kolege 1977. Poznato je i kao sekvenciranje lančanih završetaka ili Dideoxy sekvenciranje, jer se temelji na prekidu lanca dideoksinukleotidima (ddNTP). Ova se metoda široko koristila više od 30 godina dok se nije razvilo sekvenciranje nove generacije (NGS). Tehnika sekvenciranja Sangera omogućila je otkrivanje ispravnog reda nukleotida ili vezanje određenog fragmenta DNA. Temelji se na selektivnoj inkorporaciji ddNTP-a i prestanku sinteze DNA tijekom in vitro replikacije DNA. Odsutnost 3 'OH skupina za nastavak stvaranja fosfodiesterske veze između susjednih nukleotida jedinstvena je značajka ddNTP-a. Dakle, kad je ddNTP pričvršćen, produljenje lanca prestaje i završava od te točke. Postoje četiri ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP - koji se koriste u Sangerovom sekvenciranju. Ti nukleotidi zaustavljaju proces replikacije DNA kad se ugrade u rastući lanac DNA i rezultiraju različitim dužinama kratkih DNA. Elektroforeza u kapilarnom gelu koristi se za organiziranje ovih kratkih DNA lanaca prema njihovim veličinama na gelu, kao što je prikazano na slici 01.
Slika 1: Kapilarna gel elektroforeza sintetizirane kratke DNA
Za in vitro replikaciju DNA treba pružiti malo zahtjeva. Oni su enzim DNA polimeraze, predloška DNA, oligonukleotidni početnici i deoksinukleotidi (dNTP). U Sangerovom sekvenciranju replikacija DNA izvodi se u četiri zasebne epruvete, zajedno s četiri vrste ddNTP-a. Deoksinukleotidi nisu u potpunosti zamijenjeni odgovarajućim ddNTP-ovima. Smjesa određenog dNTP (na primjer; dATP + ddATP) uključena je u epruvetu i replicirana. Četiri odvojena cijevna proizvoda stavljaju se na gel u četiri odvojene jažice. Zatim se čitanjem gela može stvoriti slijed kako je prikazano na slici 02.
Slika 02: Sangerovo sekvenciranje
Sangerovo sekvenciranje važna je tehnika koja pomaže u mnogim područjima molekularne biologije. Projekt ljudskog genoma uspješno je završen uz pomoć Sangerovih metoda temeljenih na sekvenciranju. Sanger sekvenciranje također je korisno u ciljanom DNA sekvenciranju, istraživanju karcinoma i genetskih bolesti, analizi ekspresije gena, identifikaciji ljudi, otkrivanju patogena, mikrobnom sekvenciranju itd.
Postoji nekoliko nedostataka Sangerovog sekvenciranja:
- Duljina DNA koja se sekvencira ne može biti veća od 1000 baznih parova
- Istodobno se može sekvencirati samo jedan pramen.
- Postupak je dugotrajan i skup.
Stoga su s vremenom razvijene nove napredne tehnike sekvenciranja kako bi se ovi problemi prevladali. Međutim, Sanger sekvenciranje je i dalje u upotrebi zbog svojih vrlo preciznih rezultata do približno 850 fragmenata duljine baznog para.
Što je pirosekvenciranje?
Pirosekvenciranje je nova tehnika sekvenciranja DNA koja se temelji na "sekvenciranju sintezom". Ova se tehnika oslanja na otkrivanje oslobađanja pirofosfata nakon ugradnje nukleotida. U postupku se koriste četiri različita enzima: DNA polimerza, ATP sulfurilaza, luciferaza i apiraza i dva supstrata adenozin 5 'fosfosulfata (APS) i luciferin.
Proces započinje vezivanjem početnice s jednolančanom DNA matricom, a DNA polimeraza započinje s ugradnjom nukleotida koji su joj komplementarni. Kada se nukleotidi spoje (polimerizacija nukleinske kiseline), on oslobađa pirofosfatne (dvije fosfatne skupine povezane zajedno) i energiju. Svaki dodatak nukleotida oslobađa ekvimolarnu količinu pirofosfata. Pirofosfat se pretvara u ATP pomoću ATP sulfurilaze u prisutnosti supstrata APS. Stvoreni ATP pokreće konverziju luciferina posredstvom luciferaze u oksiluciferin, proizvodeći vidljivu svjetlost u količinama proporcionalnim količini ATP-a. Svjetlost detektira uređaj za detekciju fotona ili fotomultiplikator i stvara pirogram. Apiraza razgrađuje ATP i inkorporirane dNTP u reakcijskoj smjesi. dNTP dodavanje vrši se jednom odjednom. Budući da je dodatak nukleotida poznat prema ugradnji i detekciji svjetlosti, može se odrediti slijed predloška. Pirogram se koristi za generiranje nukleotidne sekvence DNA uzorka kao što je prikazano na slici 03.
Pirosekvenciranje je vrlo važno u analizi polimorfizma jednog nukleotida i sekvenciranju kratkih dijelova DNA. Visoka točnost, fleksibilnost, jednostavnost automatizacije i paralelna obrada prednosti su pirosekvenciranja u odnosu na Sangerove tehnike sekvenciranja.
Slika 03: Pirosekvenciranje
Koja je razlika između Sanger sekvenciranja i pirosekvenciranja?
Diff Article Sredina prije tablice
Sanger sekvenciranje vs pirosekvenciranje |
|
| Sanger sekvenciranje je metoda sekvenciranja DNA koja se temelji na selektivnoj inkorporaciji ddNTPs DNA polimerazom i završetkom lanca. | Pirosekvenciranje je metoda sekvenciranja DNA koja se temelji na detekciji oslobađanja pirofosfata nakon ugradnje nukleotida. |
| Korištenje ddNTP-a | |
| ddNTP se koriste za zaustavljanje replikacije DNA | ddNTP se ne koriste. |
| Uključeni enzimi | |
| Koriste se DNA polimeraze. | Koriste se četiri enzima: DNA polimeraza, ATP sulfurilaza, luciferaza i apiraza. |
| Podloge korištene | |
| APS i Luciferin se ne koriste. | Koriste se adenozin 5 'fosfosulfat (APS) i luciferin. |
| Maksimalna temperatura | |
| Ovo je spor proces. | Ovo je brz proces. |
Sažetak - Sanger sekvenciranje vs pirosekvenciranje
Sanger sekvenciranje i pirosekvenciranje dvije su metode sekvenciranja DNA koje se koriste u molekularnoj biologiji. Sangerovo sekvenciranje gradi redoslijed nukleotida u nizu završavanjem produljenja lanca, dok pirosekvenciranje gradi precizan redoslijed nukleotida u slijedu ugrađivanjem nukleotida i otkrivanjem oslobađanja pirofosfata. Stoga je glavna razlika između Sangerovog sekvenciranja i pirosekvenciranja u tome što Sangerovo sekvenciranje djeluje na sekvenciranje prekidom lanca, dok pirosekvenciranje djeluje na sekvenciranje sintezom.
