Ključna razlika - sekvenciranje mikromreže protiv RNA
Transkriptom predstavlja cjelokupni sadržaj RNA prisutne u stanici, uključujući mRNA, rRNA, tRNA, razgrađenu RNA i nerazgrađenu RNA. Profiliranje transkriptoma važan je postupak kako bi se razumjeli uvidi u stanice. Postoji nekoliko naprednih metoda za profiliranje transkriptoma. Mikroraznim i RNA sekvenciranje dvije su vrste tehnologija razvijene za analizu transkriptoma. Ključna razlika između mikro niza i RNA sekvenciranja je u tome što se mikromreža temelji na hibridizacijskom potencijalu unaprijed dizajniranih obilježenih sondi s ciljnim cDNA sekvencama, dok se RNA sekvenciranje temelji na izravnom sekvenciranju cDNA lanaca naprednim tehnikama sekvenciranja kao što je NGS. Mikroradovi se izvode uz prethodno znanje o sekvencama, a sekvenciranje RNA bez prethodnog znanja o sekvencama.
SADRŽAJ
1. Pregled i ključna razlika
2. Što je Microarray
3. Što je sekvenciranje RNA
4. Usporedba usporedno - Microarray vs RNA Sequencing
5. Sažetak
Što je Microarray?
Microarray je robusna, pouzdana i visokopropusna metoda koju znanstvenici koriste za profiliranje transkriptoma. To je najpopularniji pristup analizi prijepisa. To je jeftina metoda, koja ovisi o hibridizacijskim sondama.
Tehnika započinje ekstrakcijom mRNA iz uzorka i izgradnjom cDNA biblioteke od ukupne RNA. Zatim se pomiješa s fluorescentno obilježenim unaprijed dizajniranim sondama na čvrstoj površini (točkasta matrica). Komplementarne sekvence hibridiziraju se s obilježenim sondama u mikromreži. Zatim se mikro-niz ispere i pregleda, a slika se kvantificira. Prikupljene podatke treba analizirati kako bi se dobili relativni profili izraza.
Pretpostavlja se da je intenzitet sondi mikromreže proporcionalan količini transkripata u uzorku. Međutim, točnost tehnike ovisi o dizajniranim sondama, predznanju o slijedu i afinitetu sondi za hibridizaciju. Stoga tehnologija mikrorazreda ima ograničenja. Tehnika mikrorazreda ne može se izvoditi s prijepisima s malim obiljem. Ne uspijeva razlikovati izoforme i identificirati genetske varijante. Budući da ova metoda ovisi o hibridizaciji sondi, u tehnici mikrorazreda javljaju se neki problemi povezani s hibridizacijom, poput unakrsne hibridizacije, nespecifične hibridizacije itd.
Slika 01: Microarray
Što je sekvenciranje RNA?
Sekvenciranje RNA sačmarice (RNA seq) nedavno je razvijena cijela tehnika sekvenciranja transkriptoma. To je brza i velika propusna metoda profiliranja transkriptoma. Izravno kvantificira ekspresiju gena i rezultira dubokim istraživanjem transkriptoma. RNA seq ne ovisi o unaprijed dizajniranim sondama ili predznanju o sekvencama. Stoga, RNA seq metoda ima visoku osjetljivost i sposobnost otkrivanja novih gena i genetskih varijanti.
Metoda sekvenciranja RNA izvodi se u nekoliko koraka. Ukupna RNA stanice mora biti izolirana i fragmentirana. Zatim se, koristeći reverznu transkriptazu, mora pripremiti knjižnica cDNA. Svaki cDNA lanac mora se povezati adapterima. Tada se vezani fragmenti moraju pojačati i pročistiti. Konačno, pomoću NGS metode, mora se izvršiti sekvenciranje cDNA.
Slika 02: RNA sekvenciranje
Koja je razlika između Microarray i RNA sekvenciranja?
Diff Article Sredina prije tablice
Mikrorazređivanje vs RNA sekvenciranje |
|
| Microarray je robusna, pouzdana, visokopropusna metoda. | RNA sekvenciranje je točna i visokopropusna metoda. |
| Trošak | |
| Ovo je jeftina metoda. | Ovo je skupa metoda. |
| Analiza velikog broja uzoraka | |
| To olakšava istovremenu analizu velikog broja uzoraka. | To olakšava analizu velikog broja uzoraka. |
| Analiza podataka | |
| Analiza podataka je složena. | Ovom metodom generira se više podataka; dakle, postupak je složeniji. |
| Prethodno poznavanje sekvenci | |
| Ova se metoda temelji na hibridizacijskim sondama, pa je potrebno prethodno poznavanje sekvenci. | Ova metoda ne ovisi o prethodnom znanju slijeda. |
| Strukturne varijacije i novi geni | |
| Ova metoda ne može otkriti strukturne varijacije i nove gene. | Ova metoda može otkriti strukturne varijacije kao što su spajanje gena, alternativno spajanje i novi geni. |
| Osjetljivost | |
| Ovo ne može otkriti razlike u ekspresiji izoformi, pa ovo ima ograničenu osjetljivost. | Ovo ima visoku osjetljivost. |
| Ishod | |
| To može rezultirati samo relativnim razinama izraza. To ne daje apsolutnu kvantifikaciju ekspresije gena. | Daje apsolutnu i relativnu razinu izraza. |
| Ponovna analiza podataka | |
| To treba ponoviti kako bi se ponovno analiziralo. | Podaci sekvenciranja mogu se ponovno analizirati. |
| Potreba za određenim osobljem i infrastrukturom | |
| Posebna infrastruktura i osoblje nisu potrebni za mikromreže. | Specifična infrastruktura i osoblje potrebno za RNA sekvenciranje. |
| Tehnički problemi | |
| Tehnika mikrorazreda ima tehničkih problema kao što su unakrsna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, ograničena stopa otkrivanja pojedinih sondi itd. | RNA seq tehnika izbjegava tehnička pitanja kao što su unakrsna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, ograničena stopa otkrivanja pojedinih sondi, itd. |
| Predrasude | |
| Ovo je pristrana metoda jer ovisi o hibridizaciji. | Predrasuda je niska u usporedbi s mikromrežama. |
Sažetak - Microarray vs RNA Sekvencioniranje
Metode sekvenciranja mikromreža i RNA visoko su propusne platforme razvijene za profiliranje transkriptoma. Obje metode daju rezultate koji su u visokoj korelaciji s profilima ekspresije gena. Međutim, RNA sekvenciranje ima prednosti u odnosu na mikromrežu za analizu ekspresije gena. RNA sekvenciranje osjetljivija je metoda za otkrivanje transkripata s malim obiljem od mikromreže. RNA sekvenciranje također omogućuje razlikovanje između izoformi i identifikaciju varijanti gena. Međutim, mikrorazovi su uobičajeni izbor većine istraživača jer je sekvenciranje RNA nova i skupa tehnika s izazovima pohrane podataka i složenom analizom podataka.
