Ključna razlika - Maxam Gilbert vs Sanger Sekvenciranje
Nukleotidi su osnovne strukturne jedinice i građevni blokovi DNA. Molekula DNA sastoji se od polinukleotidnog lanca. U DNK se nalaze četiri različita nukleotida. Ti se nukleotidi sastoje od četiri različite dušične baze nazvane A (adenin), G (gvanin), C (citozin), T (timin). Redoslijed nukleotida u molekuli DNA ima veliku važnost jer kodira važne genetske informacije za rast i razvoj organizama. DNA sekvenciranje odnosi se na postupak koji određuje precizan nukleotidni slijed DNA. Postoje različite metode sekvenciranja DNA. Maxam Gilbert sekvenciranje i Sanger DNA sekvenciranje dvije su metode DNA sekvenciranja koje pripadaju sekvenciranju prve generacije. Postupak sekvenciranja Maxam Gilbert određuje baznu sekvencu kemijskim cijepanjem 5 'kraj označenih fragmenata DNA po mogućnosti na svakom od četiri nukleotida i gel elektroforezi. Postupak Sangerovog sekvenciranja određuje nukleotidnu sekvencu sintezom jednolančane DNA pomoću DNA polimeraze i dideoksinukleotida i gel elektroforeze. To je ključna razlika između Maxam Gilbert i Sanger Sequencing.
SADRŽAJ
1. Pregled i ključna razlika
2. Što je Maxam Gilbert
3. Što je Sanger sekvenciranje
4. Usporedna usporedba - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
5. Sažetak
Što je sekvenciranje Maxam Gilbert?
Maxam Gilbert sekvenciranje, također poznato i kao metoda kemijskog sekvenciranja, tehnika je koja je razvijena kako bi se odredio redoslijed nukleotida u DNA. Ovu su metodu uveli Walter Gilbert i Alan Maxam 1976. godine, a postala je popularna jer se može izravno provoditi s pročišćenom DNA. Maxam Gilbert metoda pripada prvoj generaciji DNA sekvenciranja i to je bila prva metoda sekvenciranja koju su znanstvenici široko koristili.
Osnovni princip ove metode leži u ograničavanju krajnje obilježenih fragmenata DNA na određenim bazama kemikalijama i uvjetima specifičnim za bazu i razdvajanju obilježenih fragmenata elektroforezom, kao što je prikazano na slici 01. Fragmenti se odvajaju prema veličini na gel. Budući da su fragmenti označeni, slijed molekule DNA može se lako utvrditi.
Metoda Maxam gilbert koristi kemikalije specifične za bazu kako bi razbila DNA na određenim bazama. Dvije uobičajene kemikalije nazvane dimetil sulfat i hidrazin koriste se za selektivno napadanje purina, odnosno pirimidina.
Metoda sekvenciranja Maxam Gilbert izvodi se u nekoliko koraka kako slijedi.
- Pročišćavanje sekvence DNA pomoću restrikcijskih endonukleaza
- Označavanje krajeva fragmenata DNA dodavanjem radioaktivnih fosfata
- Pročišćavanje označenih fragmenata od neobilježenih fragmenata gel elektroforezom
- Razdvajanje krajnje obilježene DNA u četiri epruvete i odvojeno tretiranje kemikalijama specifičnim za bazu
- Elektroforeza sadržaja svake epruvete na odvojenim linijama na odvajanju gela i fragmenata prema njihovoj duljini.
- Otkrivanje fragmenata autoradiografom.
Slika 01: Sekvenciranje Maxama Gilberta
Što je Sanger sekvenciranje?
Sangerovo sekvenciranje metoda je sekvenciranja koju su razvili Frederick Sanger i njegovi kolege 1977. godine kako bi se odredio osnovni slijed datog fragmenta DNA. Poznata je i pod nazivom završetak lančanog sekvenciranja ili metoda sekvenciranja Dideoxy. Ova metoda djeluje na principu selektivne inkorporacije lanca koji završavaju dideoksinukleotide (ddNTP) poput ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP pomoću DNA polimeraze tijekom sinteze jednolančane DNA kako bi se prekinulo stvaranje lanaca. Dideoksinukleotidima nedostaju 3 'OH skupine za stvaranje fosfodiesterskih veza sa susjednim nukleotidom. Stoga se formiranje niti zaustavlja kad se ddNTP ugradi u novonastalu nit tijekom sekvenciranja sangera.
Ovom metodom izvode se četiri odvojene reakcije sinteze DNA (PCR) u četiri odvojene epruvete s jednom vrstom ddNTP. Ostali zahtjevi se također isporučuju za epruvete za PCR, uključujući početnice, dNTP, Taq polimerazu, specifične uvjete itd. U četiri epruvete s četiri smjese provode se četiri odvojene reakcije. Nakon PCR reakcija, dobiveni fragmenti DNA se denaturiraju toplinom i odvajaju se gelskom elektroforezom. Zatim se fragmenti vizualiziraju pomoću označene (radioaktivne ili fluorescentne) temeljne boje ili dNTP-a kao što je prikazano na slici 02.
Slika 02: Sanger sekvenciranje
Koja je razlika između Maxam Gilbert i Sanger Sequencing?
Diff Article Sredina prije tablice
Maxam Gilbert vs Sanger Sekvenciranje |
|
| Maxam Gilbert sekvenciranje prva je tehnika razvijena za sekvenciranje DNA. | Sanger metoda sekvenciranja uvedena je nakon metode sekvenciranja Maxam Gilbert. |
| Upotreba | |
| Ova metoda se rijetko koristi. | Sanger sekvenciranje rutinski se koristi za sekvenciranje. |
| Upotreba opasnih kemikalija | |
| Koristi opasne kemikalije. | Upotreba opasnih kemikalija ograničena je u usporedbi s metodom Maxam Gilbert. |
| Označavanje za otkrivanje | |
| Ova metoda koristi radioaktivni P 32 za obilježavanje krajeva fragmenata DNA. | Sanger sekvenciranje koristi radioaktivno ili fluorescentno označene ddNTP. |
Sažetak - Maxam Gilbert vs Sanger sekvenciranje
Maxam Gilbert i Sanger sekvenciranje su dvije vrste tehnika sekvenciranja DNA koje spadaju u DNA sekvenciranje prve generacije. Sekvenciranje Maxam Gilbert prva je metoda uvedena za sekvenciranje DNA 1976. godine, a provodi se lomljenjem krajnje obilježenih fragmenata DNA pomoću kemikalija specifičnih za bazu. Stoga je poznato kao kemijsko sekvenciranje. Sangerova metoda sekvenciranja uvedena je 1977. godine, a temelji se na reakcijama prekida lanca vođenim ddNTP-om. Sanger metoda sekvenciranja popularna od metode Maxam Gilbert zbog nekoliko nedostataka metode Maxam Gilbert kao što su pretjerana potrošnja vremena, upotreba opasnih kemikalija itd. To je razlika između sekvenciranja Maxam Gilbert i Sanger.
