Ključna razlika - PCR vs DNA sekvenciranje
PCR i DNA sekvenciranje dvije su važne tehnike u molekularnoj biologiji. Lančana reakcija polimeraze (PCR) postupak je koji stvara velik broj kopija fragmenta DNA. DNA sekvenciranje je tehnika koja rezultira preciznim redoslijedom nukleotida datog fragmenta DNA. To je ključna razlika između PCR-a i DNA sekvenciranja. PCR je jedan od glavnih koraka uključenih u sekvenciranje DNA.
SADRŽAJ
1. Pregled i ključna razlika
2. Što je PCR
3. Što je sekvenciranje DNA
4. Usporedna usporedba - PCR vs DNA sekvenciranje
5. Sažetak
Što je PCR?
Lančana reakcija polimeraze (PCR) je tehnika pojačavanja DNA koja se koristi u molekularnoj biologiji. Proizvodi tisuće do milijuna primjeraka određenog fragmenta DNA. Ovu je metodu razvio Kary Mullis 1983. U ovoj tehnici fragment DNA koji se pojačava služi kao predložak, a enzim DNA polimeraza dodaje komplementarne nukleotide u početnik koji je dostupan u PCR smjesi. Na kraju PCR reakcije sintetizira se mnoštvo kopija DNA uzorka.
Postoje različite komponente PCR smjese, uključujući DNA, DNA polimerazu (Taq polimerazu), početnice (prema naprijed i unatrag), nukleotide (gradivne blokove DNA) i pufer. PCR se događa unutar PCR stroja, a u uređaj treba ubaciti ispravnu PCR smjesu i pokrenuti ispravan program. Ova tehnika omogućuje stvaranje tisuća do milijuna kopija određenog dijela DNA iz vrlo male količine DNA.
PCR reakcije odvijaju se ciklično kako bi se stvorila vidljiva količina PCR proizvoda na gelu. Tri su glavna koraka koja su uključena u PCR reakciju, a to su denaturacija, žarenje temeljnog premaza i produženje niti, kao što je prikazano na slici 01. Ova tri koraka odvijaju se na tri različite temperature. DNA postoje u dvolančanom obliku vodikovim vezama između komplementarnih baza. Prije implikacije, dvolančana DNA treba odvojiti jedna od druge. To se radi davanjem visoke temperature. Na visokoj temperaturi, dvolančana DNA denaturacija u jednostruke lance. Tada bi se početnice trebale približiti bočnim krajevima specifičnog fragmenta ili gena DNA. Primer je kratki komad jednolančane DNA koji je komplementaran ciljnom slijedu. Naprijed i natrag početni premazi se žare s komplementarnim bazama na bočnim krajevima denaturirane DNA uzorka na temperaturi žarenja. Temeljni premazi trebaju biti otporni na toplinu. Jednom kada početnice sažegnu s uzorkom DNA, enzim taq polimeraze započinje sintezu novih lanaca dodavanjem nukleotida koji su komplementarni ciljanoj DNA. Taq polimeraza je toplinski stabilan enzim izoliran iz termofilne bakterije nazvane Thermus aquaticus. PCR pufer održava optimalne uvjete za djelovanje taq polimeraze. Te se tri faze PCR reakcija ponavljaju kako bi se proizvela potrebna količina PCR proizvoda. Nakon svake PCR reakcije, broj DNK kopije se udvostručuje. Stoga se u PCR može primijetiti eksponencijalno pojačavanje. PCR proizvodi mogu se promatrati pomoću gel elektroforeze i mogu se pročistiti za daljnja ispitivanja.
Slika 01: Glavni koraci PCR reakcije
PCR je vrijedan alat u medicinskim i biološkim istraživanjima. PCR ima posebnu vrijednost u forenzičkoj znanosti jer može pojačati DNA za studije na malim uzorcima kriminalaca i napraviti forenzičke DNK profile. PCR se široko koristi u mnogim područjima molekularne biologije, uključujući genotipizaciju, kloniranje gena, otkrivanje mutacija, sekvenciranje DNA, DNA mikromreže i ispitivanje očinstva, itd.
Slika 02: Lančana reakcija polimeraze
Što je sekvenciranje DNA?
Sekvenciranje DNA je određivanje preciznog reda nukleotida - adenina, gvanina, citozina i timina u danom fragmentu DNA. Genetske informacije pohranjuju se u DNA sekvence koristeći ispravan redoslijed nukleotida. Stoga je pronalaženje preciznog poretka nukleotida u DNA fragmentu vrlo važno znati o strukturi i funkciji gena.
Protokol sekvenciranja DNA uključuje različite procese. Prvi korak je izolacija zainteresirane DNA ili genomske DNA organizma. Koristeći PCR (kako je gore opisano), željeno područje DNA treba pojačati. Pojačani PCR proizvod treba odvojiti gel-elektroforezom i pročistiti. Pojačani fragmenti služe kao predlošci za sekvenciranje. Sekvenciranje se može provesti ili slijedeći Sangerovo sekvenciranje ili metodu sekvenciranja velike propusnosti. Sanger sekvenciranje zahtijeva kapilarnu elektroforezu rezultirajućih fragmenata DNA. Određivanje ispravnog redoslijeda nukleotida može se izvršiti ručnim čitanjem autoradiografa ili pomoću automatiziranih DNA sekvencera.
Sekvenciranje gena doprinijelo je projektu Ljudski genom i olakšalo mapiranje ljudskog genoma 2003. U forenzici je DNA sekvenciranje omogućilo identifikaciju pojedinaca koji pokazuju jedinstvene sekvence DNA i identificiraju kriminalce. U medicini sekvenciranje DNA može se koristiti za otkrivanje gena odgovornih za genetske i druge bolesti, pronalaženje gena s defektima i zamjenu ispravnim genima. U poljoprivredi se podaci o sekvenciranju DNK nekih mikroorganizama koriste za proizvodnju transgenih usjeva s ekonomski željenim karakteristikama.
Slika 03: DNA sekvenciranje
Koja je razlika između PCR i DNA sekvenciranja?
Diff Article Sredina prije tablice
PCR vs DNA sekvenciranje |
|
| PCR proces stvara tisuće do milijuna kopija zainteresiranog fragmenta DNA. | DNA sekvenciranje je postupak određivanja preciznog poretka nukleotida u danom fragmentu DNA. |
| Ishod | |
| PCR stvara tisuće do milijuna kopija određenog fragmenta DNA | To rezultira ispravnim redoslijedom baza u određenom fragmentu DNA. |
| Uključenost ddNTP-a | |
| PCR ne zahtijeva ddNTP. Koristi dNTP-ove. | DNK sekvenciranje zahtijeva ddNTP da prekinu stvaranje lanaca. |
Sažetak - PCR vs DNA sekvenciranje
PCR i sljedovanje DNA vrlo su važni alati u mnogim područjima molekularne biologije. Pojačanje DNA fragmenata vrši se PCR tehnikom, dok se točnim redoslijedom nukleotida DNA fragmenta određuje DNA sekvenciranjem. To je razlika između PCR i DNA sekvenciranja.
