Ključna razlika - kloniranje vs subkloniranje
Kloniranje i subkloniranje su molekularno biološki postupci koji stvaraju genetski identične stanice ili organizme koji nose DNA ili gen koji su od interesa. Kloniranje je tehnika koja uključuje umetanje zainteresiranog gena ili DNA u vektor, njegovu replikaciju unutar bakterije domaćina i proizvodnju stanica ili organizama koji su točne kopije genetskog sastava. Subkloniranje je tehnika koja uključuje umetanje gena od interesa koji je već umetnut u vektor, u sekundarni vektor, njegovu replikaciju unutar bakterije domaćina i proizvodnju genetski identičnih kopija stanica ili organizama. Ključna razlika između kloniranja i subkloniranja je u tome što, pri kloniranju, gen koji nas zanima, jednom vezan u vektor, nastavlja postupak kloniranja dok u subkloniranjuveć klonirani gen od interesa odvaja se od roditeljskog vektora i ponovno ubacuje u vektor primatelja i nastavlja postupak.
SADRŽAJ
1. Pregled i ključna razlika
2. Što je kloniranje
3. Što je subkloniranje
4. Usporedna usporedba - Kloniranje i subkloniranje
5. Sažetak
Što je kloniranje?
Kloniranje je postupak koji stvara genetski identične organizme ili stanice. U prirodi se kloniranje događa u sredstvima nespolnog razmnožavanja. Kad nema genetske rekombinacije ili promjene, stanice kćeri dobivaju isti genetski sastav roditelja. Prokariotski i eukariotski organizmi stvaraju klonove binarnom cijepanjem, pupanjem, mitozom itd. U molekularnoj biologiji kloniranje gena ili specifičnih fragmenata DNK popularna je metoda za proučavanje strukture i funkcije tog određenog dijela DNA.
Glavni cilj molekularnog kloniranja je napraviti milijune kopija genetski identičnih stanica ili organizama koji nose DNA fragment koji nas zanima (uglavnom geni). Stvara organizme s točnim genetskim kopijama drugog. Prvenstveno se specifični geni kloniraju u molekularnim studijama kako bi se dobili strukturni i funkcionalni podaci te sekvenciranje DNA. Također, za proizvodnju specifičnih proteina ili proizvoda u velikim razmjerima, kloniranje se široko koristi.
Postupak kloniranja
Osnovni koraci postupka kloniranja su sljedeći.
- Identifikacija i izolacija gena od interesa. (Pojačanje gena od interesa pomoću PCR-a).
- Ograničena probava gena od interesa (Restrikcijska endonukleaza je odsjekla gen).
- Ograničena probava vektorske DNA. (Vektorska DNA također se reže pomoću iste restrikcijske endonukleaze).
- Umetanje gena u vektor i stvaranje rekombinantne molekule.
- Transformacija rekombinantnog vektora u bakteriju domaćina.
- Izolacija i identifikacija transformiranih bakterija (plazmidni vektor trebao bi sadržavati selektibilni gen, najčešće gen za rezistenciju na antibiotike za otkrivanje transformiranih bakterija).
- Ekspresija rekombinantnog gena unutar domaćina.
Slika_01: Postupak kloniranja
Što je subkloniranje?
Subkloniranje je postupak premještanja gena od interesa iz jednog u drugi vektor kako bi se vidjela ekspresija gena kako bi se dobila željena funkcionalnost gena. U ovoj metodi sudjeluju dva vektora; naime, nadređeni vektor i odredišni vektor. Klonirani umetci ponovno se premještaju u drugi vektor u subkloniranju. Cilj prijenosa gena iz prvog vektora u drugi vektor je dobiti nešto što prvi vektor nije mogao učiniti ili ponovno odvojiti gen unutar već kloniranog fragmenta DNA i eksprimirati ga sam. U ovom se postupku na početku koriste restrikcijski enzimi.
Postupak subkloniranja
Osnovni koraci subkloniranja su sljedeći.
- Uz pomoć restrikcijskih endonukleaza, odvajanje DNA od interesa u donatorskom plazmidu (roditeljski vektor).
- Pojačanje DNA od interesa pomoću PCR-a.
- Pročišćavanje PCR proizvoda (DNA od interesa) gel elektroforezom.
- Otvaranje primateljskog plazmida istim restrikcijskim endonukleazama koji se koriste za odvajanje DNA od interesa u roditeljskom plazmidu.
- Podvezivanje DNA od interesa (gena) u primateljski plazmid da bi se stvorio subklonirani plazmid.
- Transformacija subkloniranog vektora u nadležnu bakteriju domaćina.
- Probir transformiranih stanica.
- Pročišćavanje plazmidne DNA i upotreba za sekvenciranje DNA ili ekspresiju gena za dobivanje željenih produkata.
Subkloniranje se provodi u slučajevima izolacije jednog gena iz klonirane skupine gena ili kada je gen od interesa potreban za prijenos u korisni plazmid kako bi se vidjela točna funkcija gena od interesa.
Slika_02: Postupak subkloniranja
Koja je razlika između kloniranja i subkloniranja?
Diff Article Sredina prije tablice
Kloniranje vs Subkloniranje |
|
| Kloniranje je postupak koji stvara genetski identične organizme ili stanice. | Subkloniranje je postupak premještanja gena od interesa iz jednog u drugi vektor kako bi se vidjela ekspresija gena kako bi se dobila željena funkcionalnost gena. |
| Postupak | |
| Odvojite DNA koja vas zanima od organizma i jednom umetnite u vektor i klonirajte | Već je klonirana DNA odvojena od prvog vektora i umetnuta u drugi vektor te klonirana. |
| Umetni pokret putem vektora | |
| Ne premješta umetke (DNK od interesa) iz jednog u drugi vektor. | Premjestite umetke iz nadređenog vektora u odredišni vektor. |
Sažetak - Kloniranje vs Subkloniranje
Kloniranjem se stvaraju genetski identične stanice ili organizmi s umetnutim genom ili DNA od interesa. Nastavlja odvajanjem i umetanjem DNA od interesa u vektor i ekspresijom u bakteriji domaćinu. Subkloniranje dijeli slične korake s kloniranjem. Međutim, subkloniranjem se već klonirani fragment DNA (gen od interesa) umetne u vektor i transformira u bakteriju domaćina. To je ključna razlika između kloniranja i subkloniranja.
